Cristalización de la catalasa-peroxidasa de Neurospora crassa

Abstract

Las catalasa-peroxidasas (CP´s) son enzimas bifuncionales que han sido consideradas de interés por dos razones, la primera es que son las únicas peroxidasas con alta actividad de catalasa y la segunda por su participación en la activación del fármaco anti-tuberculosis llamado isoniazida. El plegamiento y la arquitectura del sitio activo de las CP’s son típicos de una peroxidasa. Sin embargo, mientras las peroxidasas se presentan como monómeros, las CP´s son homodímeros u homotetrámeros. Cada subunidad está formada por un dominio N-terminal y otro C-terminal. El sitio activo de las CP’s es un protohemo IX localizado en el dominio Nterminal, que presenta una triada altamente conservada His/Trp/Asp, donde el Trp forma un aducto covalente con los residuos Tyr/Met encargados de la actividad catalítica de la enzima. Además, las CP’s presentan tres asas largas denominadas LL1, LL2 y LL3, de las cuales LL1 y LL2 se encargan de restringir el paso del sustrato al centro activo. Hasta la fecha son pocos los estudios bioquímicos reportados para CP´s y sólo están depositadas seis estructuras cristalográficas en el PDB (Protein Data Bank), cuatro son de bacterias, una de arquea y una de eucariontes. Por lo anterior, en este trabajo se planteó como objetivo principal cristalizar la CP de Neurospora crassa denominada CAT-2. Previamente se clonó el gen de la CAT-2 en el vector pTYB1 y se expresó en Escherichia coli. Posteriormente la enzima fue purificada por cromatografía con una columna de afinidad. También se utilizó una columna de intercambio aniónico o una columna de exclusión molecular. Se determinó el punto isoeléctrico de la enzima utilizando un equipo Phastsystem obteniendo un valor de pI experimental de 5, que es similar al teórico. Los análisis de dispersión dinámica de luz (DLS) mostraron la capacidad termoestable de la CAT-2 en altas temperaturas (40°C), además de revelar la pureza de la muestra ya que durante estos ensayos la enzima se mantuvo homogénea y monodispersa en solución, aún con la implementación de tres amortiguadores diferentes. Se realizaron pruebas de cristalización de la CAT-2 con el método de “batch” y también pruebas de gota colgante y gota sentada utilizando el robot de cristalización “Mosquito LCP”. Una vez que se encontraron las condiciones de cristalización se realizaron matrices de optimización y escalado, en las que se varió la concentración de las soluciones madre con el fin de conseguir mejores cristales. De los cristales que se obtuvieron, nueve fueron congelados y difractados en líneas de los sincrotrones de Brookhaven y Stanford. Así, se comprobó que eran cristales de la enzima. Aunque desafortunadamente ninguno presentó la calidad suficiente para realizar una colecta de datos y determinar la estructura cristalográfica de la CAT-2. Con el fin de conocer más sobre la CAT-2 se realizaron dos análisis de su secuencia utilizando los programas XtalPred y ProtParam. Los resultados de XtalPred indicaron que la CAT-2 es una enzima difícil de cristalizar, ya que presenta regiones desordenadas en su secuencia. Con ProtParam se determinaron algunos parámetros teóricos de la CAT-2, como la masa molecular y el pI. También, su secuencia fue alineada con las secuencias de las otras CP´s que tienen determinada su estructura cristalográfica utilizando el programa BioEdit para identificar los residuos de aminoácidos importantes en la CAT-2. Asimismo a estas secuencias se les realizó un análisis de BLAST para determinar el porcentaje de identidad entre la CAT-2 y otras CP’s. Finalmente, se generó un modelo tridimensional con la secuencia de la CAT-2, con el fin de analizar algunas características de la enzima. El modelo se construyó considerando la identidad de la CAT-2 y las otras CP´s cuya estructura se conoce, especialmente con la CP de Magnaporthe grisea con la que tiene un 62% de identidad de secuencia. El modelo se realizó utilizando el programa SWISS MODEL de ExPASy. En el modelo de la CAT-2 observamos que es muy parecido a la estructura cristalográfica de M. grisea.